citogenetica

Ramo della genetica che studia le relazioni tra i dati ricavati dallo studio dei caratteri genetici, della loro trasmissione e della loro manifestazione, e i dati ricavati dall’osservazione diretta dei cromosomi.

Il maggior progresso compiuto negli ultimi anni nel campo della c. è rappresentato dallo sviluppo della tecnica denominata FISH (fluorescent in situ hybridization). Essa fornisce uno strumento diretto per identificare anomalie cromosomiche associate a malattie ereditarie o a tumori, per localizzare sequenze specifiche di DNA sui cromosomi e per mappare i geni. La tecnica prevede la preparazione di sonde di DNA specifiche, marcate mediante incorporazione di nucleotidi modificati e rivelabili generalmente a causa del loro legame con una molecola fluorescente. Le sonde di DNA a filamento singolo vengono poi ibridate o sui cromosomi in metafase, allestiti con tecniche di c. classica utilizzando le cellule in divisione, oppure sui nuclei di cellule in interfase non in divisione. Il potere di risoluzione di questa tecnica nei cromosomi metafasici non è molto elevato e può variare da una a diverse megabasi di DNA, mentre nei nuclei interfasici è di circa 50-500 chilobasi. La FISH è stata messa a punto nella seconda metà degli anni 1980, ma negli anni successivi la sua utilizzazione è andata via via aumentando, anche grazie ai progressi tecnologici che hanno permesso sia di produrre una grande varietà di sonde sia di migliorare la qualità delle immagini attraverso l’elaborazione mediante computer. Molte delle sonde attualmente utilizzate sono specifiche per un dato locus genico e sono state ottenute mediante la clonazione di segmenti di DNA in vettori, quali YAC o fagi, oppure mediante amplificazione del DNA con PCR. Il successo ottenuto dal Progetto genoma nel sequenziamento dei geni umani e di altre specie, tra la fine del 20° e l’inizio del 21° sec., ha reso disponibile un numero crescente di questo tipo di sonde; la FISH è così divenuta il metodo di elezione sia per controllare mappe geniche prodotte con altre metodiche, sia per localizzare e ordinare rapidamente le nuove sonde che vengono clonate (➔ mappa). Altri tipi di sonde sono quelle che ibridano con i centromeri dei diversi cromosomi umani (sonde alfoidi), basate su brevi sequenze di DNA ripetute testa-coda. Esse producono segnali intensi sia sui cromosomi in metafase sia sui nuclei interfasici e sono state commercializzate in quanto molto utili per l’identificazione di specifici cromosomi. La tecnica di separazione dei singoli cromosomi con la citometria a flusso (➔ citometria) ha permesso inoltre la preparazione di sonde da genoteche di DNA specifiche per ogni cromosoma. Utilizzando queste miscele di DNA che presentano omologia con molti loci di uno stesso cromosoma, al microscopio a fluorescenza si osservano interi cromosomi colorati (chromosome painting). Con combinazioni di fluorocromi e con tecniche sofisticate di elaborazione di immagini si può ottenere una colorazione diversa per ciascuna coppia di cromosomi omologhi in una stessa metafase.

Nell'ultimo decennio del Novecento è stata anche messa a punto una tecnica di microdissezione su vetrino, mediante aghi sottilissimi, di regioni cromosomiche specifiche. Questi frammenti cromosomici, amplificati con PCR, consentono di ottenere sonde specifiche in tempi rapidi, senza clonare il DNA. Altre recenti tecnologie sono la FISH su fibra di DNA (DNA fiber-FISH) e l’ibridazione genomica comparativa (CGH, comparative genomic hybridization). La DNA fiber-FISH utilizza DNA in forma lineare non fissato su vetrino e privo di proteine, preparato da cellule incluse in blocchetti per l’elettroforesi in campo pulsato. Il potere di risoluzione di questo metodo è molto elevato (da 500 a poche chilobasi). Mediante CGH si possono invece saggiare in un unico esperimento tutte le regioni di amplificazione genica insieme a tutte le regioni con perdite di un allele, cioè le aneuploidie. Questa tecnica è risultata particolarmente utile nelle cellule tumorali. Con l’aiuto di un analizzatore di immagini computerizzato si possono individuare le regioni cromosomiche in cui il rapporto fra i segnali FISH del DNA normale e di quello tumorale devia dai valori attesi; a seconda delle deviazioni si caratterizzano le regioni dove sono presenti le amplificazioni o le perdite.