Western blot

Western blot

Metodica biochimica utile a individuare una proteina in un dato campione di omogenato tessutale o estratto cellulare. Il metodo, detto anche immunoblot, è stato messo a punto nel laboratorio di George Stark a Stanford. Il nome Western blot è stato dato alla tecnica da W. Neal Burnette nel 1981 in analogia al nome – coniato anni prima da Edwin Southern – della tecnica Southern blot di utilizzo in biologia molecolare per l’identificazione del DNA. L’identificazione dell’RNA era stata chiamata sempre per analogia di nome Northern blotting. Il Western blot prevede l’utilizzo di una elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodiododecilsolfato (SDS-PAGE) per la separazione delle proteine, previamente denaturate al calore, sulla scorta della loro massa molecolare. Le proteine sono successivamente trasferite dal gel su una membrana, tipicamente di nitrocellulosa, dove sono riconosciute e legate da anticorpi specifici. Come risultato è possibile identificare e quantificare una data proteina contenuta in un campione. Il Western blot analiticamente consta delle seguenti fasi: (a) preparazione del campione (per es., omogenazione/estrazione, centrifugazione e bollitura per la denaturazione delle proteine in sample buffer); (b) gel elettroforesi; (c) trasferimento (transfer) su membrana; (d) blocco dei siti aspecifici della membrana, di solito con albumina bovina (BSA) o latte; (e) identificazione della proteina ricercata mediante ibridazione con anticorpi (un primario che riconosce l’antigene a cui segue un secondario, coniugato a un sistema di rivelazione, che riconosce il primario); (f ) rivelazione del legame anticorpo-antigene solitamente mediante reazione colorimetrica o in chemioluminescenza (ECL).

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