PCR quantitativa
PCR quantitativa
Metodo rapido per misurare la quantità di una specifica sequenza di DNA presente in un campione biologico. Accoppiata a una precedente reazione di trascrittasi inversa (RT-PCR, Retro transcriptase-Polymerase chain reaction), che trasforma l’RNA presente in un campione in DNA complementare (cDNA), la PCR quantitativa (qPCR) permette di quantificare anche le molecole di RNA messaggero e quindi di misurare il livello di espressione di uno specifico gene. La PCR (o reazione a catena della polimerasi) è una reazione enzimatica che amplifica una sequenza specifica di DNA in modo teoricamente esponenziale, dato che a ogni ciclo di amplificazione l’enzima polimerasi raddoppia le molecole di DNA presenti nella reazione. Quindi, dal numero di cicli di amplificazione e da una misura quantitativa del prodotto finale sarebbe in teoria possibile risalire alla quantità di DNA iniziale. In pratica, questo calcolo sarebbe valido soltanto se si avesse la certezza di quantificare il prodotto mentre la reazione è ancora in fase di amplificazione esponenziale, prima che si arresti raggiungendo un plateau per l’esaurimento di qualche substrato essenziale o per inattivazione dell’enzima. Sono stati, perciò, sviluppati alcuni strumenti e una chimica della reazione di PCR che permettono di misurare in tempo reale l’andamento della reazione di amplificazione. I metodi più sensibili utilizzano la tecnologia Taqman→ o quella del SYBR Green. Nel primo caso, alla reazione di amplificazione è aggiunta una sonda costituita da un oligonucleote a singola elica complementare all’amplicone, cioè alla regione di DNA compresa tra le due sequenze primer. Alle due estremità della sonda sono attaccati covalentemente un fluoroforo e un quencher, una molecola capace di inibire la fluorescenza del fluoroforo. A ogni ciclo di amplificazione, questa sonda ibriderà con l’amplicone ma, al successivo passaggio della polimerasi, sarà degradata dall’attività esonucleasica 5′→3′ dell’enzima, liberando così il fluoroforo, la cui fluorescenza, non essendo più inibita dalla vicinanza del quencher, potrà essere rilevata dall’apparato di misura dello strumento. La quantità di fluoroforo rilasciato sarà direttamente proporzionale al numero di copie di DNA prodotte e quindi al numero di molecole stampo di DNA inizialmente presenti nella reazione. Il SYBR Green, invece, è un colorante fluorescente capace di legare specificamente il DNA a duplice elica formando un complesso che assorbe luce blu (λmax=488 nm) ed emette luce verde (λmax=522 nm). Aggiunto a una reazione di PCR, si complesserà con il DNA a duplice elica man mano che esso verrà prodotto e ne permetterà la misura in tempo reale da parte della strumentazione.