mutagenesi
mutagenesi
Insieme dei processi chimico-fisici che portano a una mutazione. In senso più stretto, la tecnica con cui si altera la sequenza di basi del DNA per analizzarne gli effetti sulla funzione del gene o del DNA stesso. La tecnica di m. può essere diretta a un sito specifico in un modo predeterminato, o può essere casuale.
Mutagenesi casuale
Il trattamento con determinati agenti chimici o fisici (mutageni) può aumentare in modo significativo la frequenza degli eventi mutazionali al di sopra del tasso di m. spontanea. Sono possibili vari meccanismi:
• Le radiazioni possono causare danni genetici rompendo i cromosomi, producendo composti chimici capaci di alterare il DNA (raggi X) o causando la formazione di legami inusuali fra le basi del DNA stesso, quali i dimeri di timina (formati dall’azione dei raggi UV).
• Gli analoghi di base rimpiazzano le basi normali durante la replicazione del DNA, modificando la configurazione molecolare così da mutare le loro proprietà di appaiamento e da determinare un cambio di basi corrispondenti alla loro posizione.
• Alcuni agenti possono determinare un danno diretto alle basi causando cambiamenti chimici, e alterando perciò le proprietà di appaiamento
• Gli agenti intercalanti (molecole capaci di inserirsi tra i filamenti di DNA, per es. gli inibitori delle topo isomerasi) vengono inseriti tra basi adiacenti durante la replicazione, causando inserzione o delezione di singole coppie di basi. Il risultato che ne deriva è una mutazione chiamata frameshift.
Se il danno genetico causato dal mutageno non è riparato, ne deriva una mutazione. Questa m. è condotta su organismi modello o colture cellulari. Per es., l’esposizione di topi maschi a dosi elevate di un potente mutageno e un successivo accoppiamento sono una forma di m. casuale per produrre nuovi mutanti.
Mutagenesi sito-specifica
Tecnica con cui è possibile mutare in modo selettivo il DNA in vitro, reinserirlo di nuovo nella cellula per infezione o trasformazione, ed esaminare gli effetti della mutazione. Con questa metodica si possono fare mutazioni in posizioni nucleotidiche specifiche all’interno di un gene. Tale metodica richiede in genere la conoscenza della sequenza di tipo selvatico (wild type) del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita può essere una sostituzione di base o un’inserzione o delezione di nucleotidi rispetto alla sequenza originaria. La principale tecnica di m. sito-diretta impiega l’impianto sperimentale della tecnica PCR (➔), utilizzando specifiche sequenze di DNA (oligonucleotidi) contenenti la mutazione desiderata. Questi oligonucleotidi sono quindi incorporati nella porzione di DNA da alterare e quest’ultima è inserita nelle cellule-bersaglio con opportune tecniche di biologia cellulare.
