espressione genica. Silenziamento dell’espressione genica con siRNA

espressione genica. Silenziamento dell’espressione genica con siRNA

L’RNA interference (RNAi) è un meccanismo di regolazione dell’espressione genica mediato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA, double strand RNA). L’RNAi è un fenomeno naturale che avviene sia nelle piante che negli animali.

I siRNA

I siRNA (short-interfering RNA) sono le molecole effettrici dell’RNAi. I siRNA sono lunghi 21÷25 nucleotidi con due nucleotidi protrudenti all’estremita 3', e derivano da precursori più lunghi che vengono riconosciuti e tagliati dalla endonucleasi dicer. Tale enzima è coinvolto anche nel processamento dei miRNA. In seguito al processamento dell’RNA, i siRNA sono incorporati in un complesso multiproteico chiamato RISC (RNA-Induced Silencing Complex) che guida il legame tra il siRNA e lo specifico mRNA con conseguente degradazione dell’mRNA target. L’effetto finale di tale processo è il silenziamento dell’espressione di un determinato gene. In questo caso si parla di silenziamento post-trascrizionale (PTGS, Post-Transcriptional Gene Silencing). In alcuni casi i siRNA possono regolare l’espressione genica attraverso l’inibizione della trascrizione. Ciò avviene attraverso l’induzione da parte del siRNA di modificazioni epigenetiche a livello di DNA che portano a un blocco della trascrizione. In questo caso si parla di silenziamento a livello trascrizionale (TGS, Transcriptional Gene Silencing). I siRNA e il fenomeno dell’RNAi sono stati scoperti casualmente tra la fine degli anni Ottanta e l’inizio degli anni Novanta del 20° secolo. Ricercatori americani e olandesi che lavoravano nel campo della biologia vegetale introdussero nella petunia dai fiori viola un gene codificante la proteina responsabile del colore viola dei petali del fiore al fine di ottenere piante dai colori più intensi. Con loro grande sorpresa trovarono che tale gene, anziché causare un’intensificazione del colore, portava alla generazione di petunie con fiori bianchi. La conclusione dei ricercatori fu che il gene introdotto aveva causato lo spegnimento di sé stesso e del gene endogeno, entrambi responsabili del colore viola dei fiori. Per questo motivo, il fenomeno fu inizialmente definito come co-soppressione dell’espressione genica. In maniera simile, l’infezione di piante con virus a RNA geneticamente modificati per contenere frammenti di geni della pianta portava a un silenziamento del corrispettivo gene endogeno. I ricercatori chiamarono questo fenomeno silenziamento genico indotto da virus. Tuttavia, in entrambi i casi, il meccanismo molecolare alla base di questi eventi rimaneva ignoto. Tutte le osservazioni furono correttamente comprese e interpretate nel 1998 quando A. Fire e C. Mello pubblicarono la loro scoperta dell’RNAi, per la quale hanno ricevuto il premio Nobel per la medicina o la fisiologia nel 2006. I due ricercatori americani dimostrarono che l’iniezione in Caenorhabditis elegans di un RNA a doppio filamento contenente un filamento complementare a una regione di un mRNA prodotto dal genoma del verme causava un silenziamento del gene target.

Ruolo dei siRNA

Oltre che dalle piante e da C. elegans, è stato in seguito trovato che i siRNA vengono prodotti anche dal moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, e dagli ovociti di topo. Le funzioni principali dei siRNA sono di difesa contro le infezioni da parte di virus e di regolazione degli elementi trasponibili. Ciò avviene principalmente attraverso l’appaiamento dei siRNA con i geni virali o con i trasposoni prodotti dalla cellula stessa: tale appaiamento causa la degradazione dell’RNA complementare e quindi il silenziamento di quel determinato prodotto genico.

Meccanismo d’azione dei siRNA'. In seguito al processamento dei siRNA da parte della endonucleasi dicer, l’RNA a doppio filamento di circa 22 nucleotidi si associa con le proteine della famiglia delle argonaute che, insieme ad altre proteine, costituiscono il complesso RISC. A questo punto però solo uno dei due filamenti dell’RNA rimane associato al RISC (filamento guida o effettore) mentre l’altro viene degradato (filamento passeggero). La stabilità termodinamica delle estremità dei due filamenti che costituiscono l’RNA a doppio filamento determina la selezione del filamento effettore: in genere viene selezionato il filamento che ha un appaiamento più instabile al 5'. In seguito all’appaiamento dell’RNA a singolo filamento con il corrispettivo mRNA target, si ha la degradazione dell’mRNA. Ciò avviene prevalentemente a opera della proteina Ago-2

Utilizzo dei siRNA a scopo terapeutico'. Il controllo dell’espressione di geni associati a malattie fa dell’RNAi una scelta valida per lo sviluppo di future terapie. L’RNAi può essere ottenuto in due modi: un approccio basato sulla somministrazione di un siRNA sintetico diretto contro il gene di interesse; oppure tramite strategie basate sulla somministrazione di DNA codificante un precursore del siRNA che, dopo trascrizione e processamento all’interno della cellula, dà origine al siRNA effettore. L’uso di un siRNA sintetico è più vantaggioso perché generalmente provoca un silenziamento molto efficiente, ma ha lo svantaggio di avere un effetto transiente. Al contrario, una terapia basata su DNA codificante siRNA ha il vantaggio di garantire un’espressione più stabile. Le prime applicazioni cliniche del siRNA sono state dirette verso il trattamento della degenerazione maculare senile, che ogni anno causa cecità o vista limitata in milioni di adulti. Sono in fase di sviluppo terapie basate sull’RNAi dirette contro le infezioni virali, tra cui il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), i virus dell’epatite B e C (HBV e HCV) e il virus respiratorio sinciziale (RSV). Si stanno anche studiando strategie basate sull’RNAi per combattere malattie neurodegenerative, cardiovascolari e tumori.