restrizione, enzima di
restrizione, enzima di
Proteina di origine batterica appartenente alla classe delle endonucleasi. A oggi se ne conoscono centinaia, provenienti da diversi batteri. Gli enzimi di r. agiscono come forbici in quanto sono in grado di ‘tagliare’ la doppia elica del DNA di qualsiasi organismo (diverso da quello del batterio di provenienza). Gli enzimi di r. in genere tagliano, in corrispondenza di siti specifici (siti di restrizione), sequenze di DNA che vanno da quattro a otto nucleotidi. Il sito di r., specifico per ciascun enzima, è costituito da sequenze palindromiche, ossia dotate di simmetria bilaterale nella composizione nucleotidica, per cui dalla sequenza da sinistra a destra di un’elica si ottiene la composizione dell’elica complementare da destra a sinistra. Esistono due tipi di enzimi di r.: alcuni creano tagli sfasati nella doppia elica, dando luogo a polinucleotidi con estremità ‘coesive’ (sticky ends), in cui uno dei due filamenti di DNA presenta nucleotidi non appaiati e sporgenti, mentre altri creano tagli netti e ne risultano estremità piatte, prive di estensione (blunt ends). L’azione della maggior parte degli enzimi di restrizione è influenzata dallo stato di metilazione del DNA, ossia da modificazioni post-replicative del DNA che comportano la formazione di legami covalenti tra gruppi metilici e basi azotate (➔ epigenetica).
Applicazioni degli enzimi di restrizione
Gli enzimi di r. vengono correntemente impiegati sia nella ricerca di base sia per scopi applicativi. Nel campo della biologia molecolare, gli enzimi di r. sono essenziali per studiare la funzione dei geni: il gene d’interesse viene tagliato con determinati enzimi di r. e inserito in un vettore di espressione che, digerito con gli stessi enzimi, contiene estremità compatibili. Il gene inserito nel vettore di espressione può così essere amplificato ed espresso in cellule allo scopo di studiarne la funzione. Un altro utilizzo molto importante degli enzimi di r. è la determinazione di polimorfismi (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). L’analisi della composizione del genoma umano ha indicato la presenza di un certo numero di modifiche nelle singole basi del DNA fra i diversi individui, denominate polimorfismi. Una conseguenza di questi polimorfismi può essere l’alterazione del taglio da parte degli enzimi di r.: quindi, differenze nel profilo di frammentazione di due tratti di DNA indicano differenze nella sequenza di DNA di quei frammenti. La tecnica di RFLP viene utilizzata per scopi diagnostici in caso di malattie genetiche ereditarie, quali la distrofia muscolare di Duchenne, l’emofilia e la corea di Huntington.