EMBRIOLOGIA

EMBRIOLOGIA (XIII, p. 868)

Embriologia sperimentale. - I progressi di questa disciplina si sono andati sempre più estendendo ed affermando nel campo sperimentale con il precipuo scopo di risalire alle cause prime dello sviluppo embrionale e di approfondire la natura dell'organizzazione germinale cui le ricerche moderne sono v-nute attribuendo sempre maggiore importanza, illustrandone la genesi dai più precoci stadî dello sviluppo ed i fattori che ne assicurano il regolare e progressivo complicarsi per il raggiungimento della forma dell'adulto. Il conflitto preformismo-epigenesi si è concluso con un compromesso fra le due opposte opinioni: l'uovo è così un sistema eterogeneo altamente organizzato, ma non così rigidamente, e le sue singole parti sono passibili di regolazioni, influenzandosi reciprocamente.

I perfezionamenti delle tecniche hanno resa ancora più minuziosa ed esatta l'analisi dei fenomeni dello sviluppo con aggressioni ingegnose e audaci sull'uovo e sui primi stadî embrionali.

Lo studio delle potenze dell'uovo e delle cellule in cui esso si divide, che ebbe inizio fra gli ultimi anni del secolo scorso ed i primi del nostro, con i grossolani esperimenti di cauterizzazione (W. Roux, 1884), di puntura, di frammentazione delle uova mediante scotimento, si è perfezionato con l'uso di aghi sottilissimi di vetro o di altro materiale fusibile, per tagliare, asportare, o di micropipette per aspirare, manovrati a mano o dai micromanipolatori dei quali quelli di tipo modernissimo (P. De Fonbrune) permettono finanche la fabbricazione dei microstrumenti, con speciali microforgie, al microscopio. Le tecniche per l'isolamento o il trapianto di un territorio del germe, talora costituito di poche cellule, con lo scopo di sottrarlo alle influenze delle adiacenze e trasferirlo in nuove sedi, che tanto efficacemente furono applicate, dopo G. Born (1894), in quei capolavori sperimentali di R. G. Harrison negli Stati Uniti e di H. Spemann in Germania, su materiale di anfibî, sono state estese con successo ad uova di altre classi di vertebrati e di alcuni tipi di invertebrati, e perfezionate dalle metodiche degli espianti, innesti e trapianti.

Altri espedienti per ottenere traumi e difetti assai circoscritti nell'uovo, si sono attuati con irradiazioni localizzate mediante raggi X ed ultravioletti e si è giunti così alla tecnica della microraggio puntura di S. Tschakotine che permette di utilizzare un pennellino di raggi per enucleare l'uovo; altri hanno realizzato lo stesso risultato con uova grosse come quelle degli anfibî, aspirando il nucleo a mezzo di una pipetta. Di più vecchia data i metodi della compressione delle uova fra due lastrine, la legatura e relativa costrizione a mezzo di lacci sottili di capello, la centrifugazione e, di oggi, la ultracentrifugazione.

Ma da quando nuovi dati sono venuti a rafforzare la presunzione che alla base dell'organizzazione dell'uovo sta una particolare architettura chimica e un tipico "modello" di chimismo, alle tecniche testé elencate che hanno caratterizzato questo periodo, per così dire classico, dell'embriologia sperimentale, si sono venute associando, perfezionandosi negli ultimissimi anni, metodiche specializzate, vere microtecniche citochimiche e istochimiche con metodi assai fini ed esatti e ne è sorta un'embriologia chimica che non è la descrizione delle sostanze chimiche presenti nel germe, bensì la combinazione delle tecniche della biochimica con le metodiche dell'embriologia sperimentale, con lo scopo d'indagare tutte quelle complesse azioni e reazioni che accompagnano, e in alcuni casi determinano, i processi dello sviluppo. Le recenti compendiose opere di J. Needham (1942) e di J. Brachet (1944) rappresentano magistrali sintesi del cammino percorso in così breve tempo da questo fecondo indirizzo.

La scoperta di H. Spemann (1918-21) di un "centro organizzatore" dello sviluppo dell'uovo di anfibî, cioè di una zona del germe (il labbro dorsale del blastoporo) che presiede e governa la morfogenesi, veniva a porre i problemi della determinazione e del differenziamento embrionale su nuove basi: era la rivelazione della dipendenza specifica dello sviluppo del sistema nervoso (la piastra midollare presuntiva) da un altro abbozzo: quello della corda e del mesoderma (organizzatore).

L'interesse di questa che è stata, invero, una "rivoluzionaria" scoperta, spingeva gli embriologi a ricercare con l'esperimento analoghi centri organizzatori nelle uova di altre classi di vertebrati e negli invertebrati. Le indagini, con le varianti di tecnica suggerite o imposte dai materiali differenti, sono state coronate da buon successo. Si riusciva così a dimostrare che il territorio blastoporale dell'uovo dei ciclostomi (H. Bytinski-Salz, 1936-37), il margine embriogenetico del blastoderma dei pesci (W. Luther, 1935; J. M. Oppenheimer, 1936), la linea primitiva del blastoderma di pollo (C. H. Waddington, 1931 e segg.) e dei mammiferi (J. Jolly e C. Lieure, 1937), cioè territorî tutti corrispondenti all'abbozzo mesodermico presuntivo, sono dotati di facoltà induttrici; l'induzione neurale è quindi l'espressione fondamentale di una influenza morfogenetica dell'organizzatore che stimola l'ectoderma a differenziarsi in sistema nervoso anziché in epidermide. Questi risultati ottenuti con le più svariate operazioni di trapianto embrionale (v. innesti e trapianti) si sono potuti realizzare in un logico svolgimento di esperienze, per la conoscenza sempre più esatta del piano topografico degli abbozzi presuntivi nella blastula e nella gastrula degli anfibî prima, degli uccelli e dei pesci dopo, ottenuta marcando con colori vitali (blu Nilo, rosso neutro, ecc.) i varî territorî e potendo così seguire i loro spostamenti (recentemente nel blastoderma di pollo si è dimostrato assai più conveniente l'uso del nero animale).

Anche negli invertebrati sono stati individuati centri organizzatori e per il differenziamento, che hanno fatto completamente mutare le precedenti opinioni a proposito di localizzazioni dei materiali cosiddetti organo-formativi.

Le uova di echinodermi, che fino dal 1891 erano assurte alla più grande notorietà per la scoperta di H. Driesch della totipotenza dei blastomeri isolati, sono state sottoposte ad una minuziosa analisi sperimentale dagli zoologi della scuola scandinava (J. Runnström, S. Hörstadius) isolando e combinando fra loro, a mezzo di precise operazioni eseguite con aghi, serie di blastomeri tratte dai diversi livelli dell'asse polare dell'uovo. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il concetto di localizzazioni intese come qualche cosa di statico, deve essere sostituito da quello di una distribuzione graduata di tendenze legate a determinati chimismi secondo due gradienti opposti fra loro, interreagenti dal polo animale a quello vegetativo e dall'antipolo al polo (J. Runnström). Ogni causa che interrompa perciò questo equilibrio che regola lo sviluppo normale, sposta le qualità formative dei blastomeri dell'emisfero animale (ectoderma) che possono venire "endodermizzati", o di quelli dell'emisfero vegetativo (endomesoderma) che possono venir "ectodermizzati". Il massimo di tendenze ectodermiche corrisponde infatti al polo animale e si attenua in senso opposto; il massimo di quelle endomesodermiche risiede al polo vegetativo da cui hanno origine i micromeri e si attenua in senso contrario. La polarità dell'uovo che Th. Boveri stesso (1901) aveva espresso in termini di gradienti (Gefälle) è effettivamente tale.

Sven Hörstadius ha dimostrato inoltre che basta, con una delicata operazione di trapianto, inserire una serie di micromeri in una emiblastula derivata dall'emisfero animale dell'uovo e che, come tale, mai gastrulerebbe ed anzi mostrerebbe esaltate le sue qualità ectodermiche, per vedere indotta nel materiale ectodermico la formazione di un archenteron. La regione del polo vegetativo dell'uovo può considerarsi dunque, sotto un certo aspetto, corrispondente ad un centro organizzatore.

In questi ultimi anni sono state anche riprese con nuovi criterî le ricerche sulle potenze dell'uovo di ascidie che, come è noto, era considerato un tipico "mosaico" con una precoce segregazione di localizzazioni e di plasmi (mioplasma, chimoplasma, cordo-neuroplasma) che E. G. Conklin (1905-11) aveva magistralmente illustrato. Anche in queste uova lo studio dello sviluppo di frammenti e di extraovati ha messo in evidenza tanto nell'uovo vergine, quanto nell'uovo indiviso, ma già fecondato, accentuate capacità regolative, tali da permettere che una parte possa svilupparsi in una larva completa (G. Reverberi, 1931; A. M. Dalcq, 1932). Sempre su frammenti dell'uovo vergine e fecondato, G. Reverberi e M. Pitotti (1939) hanno potuto mettere in evidenza il carattere parziale della segmentazione che risulta determinata, così come la simmetria bilaterale, da fattori insiti all'emisfero vegetativo dell'uovo. Separando i quartetti animali da quelli vegetativi, lo stesso Reverberi con A. Minganti (1945) indicava in questi blastomeri la presenza di fattori per il differenziamento del cervello e degli organi di senso dal materiale neurale presuntivo, cioè l'esistenza di un centro "attivatore".

Da questi e da tanti altri fatti che sono stati appurati sulle uova di altri invertebrati (ad es. insetti) si può arguire che in generale le attività induttrici o, per gli invertebrati, qualche cosa che a loro strettamente si assomiglia, hanno un importantissimo ruolo nello sviluppo e nella determinazione.

Si può dire che le ricerche di embriologia sperimentale, dalla scoperta dello Spemann ad oggi, siano state prevalentemente rivolte allo studio di queste attività. Che sostanze chimiche, sostanze legate a particolari metabolismi fossero le responsabili dei fenomeni d'induzione, e che da esse dipendessero in gran parte le attività morfogenetiche, veniva suggerito già dalle prime ricerche, compiute dal 1924 in poi dalla scuola dello Spemann sugli anfibî, che portarono le prime luci sulla natura dello stimolo inducente. Le ben note esperienze di trapianto ed espianto di J. Holtfreter (1933 e segg.) dimostrarono poi la generica esistenza in tutti i tessuti animali, sottoposti ai più brutali trattamenti, di una o più sostanze inducenti senza origine specifica. Anche nell'adulto ricerche di autori russi mettevano in luce (dal 1938 al 1941) che sostanze chimiche estraibili da varî tessuti differenziati potevano influenzare induttivamente la rigenerazione di nuovi tessuti.

L'embriologia sperimentale si è venuta così trasformando in embriologia chimica, sia nel ricercare le differenze di architettura chimica che sono alla base delle localizzazioni e, in generale, della organizzazione dell'uovo tenendo conto del diverso comportamento delle uova con tendenze regolative e delle altre a mosaico, sia nell'indagare la natura chimica dello stimolo inducente dell'organizzatore e il meccanismo dell'azione induttrice.

Le metodiche di cui si serve sono citochimiche ed istochimiche, le prime a carattere puramente qualitativo utili a analizzare i costituenti chimici (protidi, lipidi, glucidi) della cellula uovo e dei suoi componenti, nonché la loro distribuzione topografica; le seconde, meno perfette, ma a carattere quantitativo, che permettono di analizzare e seguire un fenomeno chimico-fisiologico durante il suo svolgersi come la respirazione, la glicolisi, il variare dell'uovo in enzimi, ecc., e così anche dei blastomeri singoli, e questo con tecniche colorimetriche, manometriche, ecc.

Per quanto riguarda gli invertebrati si è potuto, ad es., appurare che le reazioni citochimiche tipiche dell'uovo di ascidie sono assai diverse di quelle dell'uovo di riccio di mare. P. E. Lindahl (1936) avrebbe inoltre dimostrato, in queste uova, l'esistenza di due metabolismi, qualitativamente differenti, associato l'uno, del polo animale, alla disintegrazione dei carboidrati, l'altro, del polo vegetativo, a quella delle proteine, e con i sali di litio, che inibiscono la combustione dei carboidrati, ha interrotto quell'equilibrio di tendenze formative dell'ectoderma e dell'endomesoderma messo in evidenza sul piano morfologico da S. Hörstadius, facendo cioè predominare quelle endomesodermiche con conseguente "vegetativizzazione" e quindi exogastrulazione. Il potassio invece avrebbe una azione antagonista a quella del litio, producendo "l'animalizzazione" del materiale vegetativo.

Qualche riserva a questa interpretazione hanno fatto di recente alcuni americani (A. R. Moore, H. S. Bliss e E. H. Anderson, 1945) studiando gli effetti della piocianina e del litio sulla respirazione e sullo sviluppo dell'uovo di riccio di mare. Sempre sullo stesso materiale e nel campo chimico, D. C. Pease (1940) facendo agire varî agenti tossici sull'uovo, avrebbe indicato che la determinazione dell'asse dorso-ventrale si compie per influenza della citocromoxidasi.

Nei vertebrati e particolarmente sull'uovo di anfibî, le ricerche di embriologia chimica sono assai più numerose. È risultato che un subitaneo cambiamento di metabolismo si avvera durante la gastrulazione: così ad es. mentre le cellule dell'organizzatore nelle fasi iniziali e precedenti il processo contengono glicogeno in grado elevato, nei territorî già invaginati della gastrula esso è scarsissimo e tende a scomparire (ricerche di N. W. Woerdeman 1933). Il territorio del labbro dorsale del blastoporo sarebbe dunque caratterizzato da un particolare metabolismo in prevalenza glucidico. Assumono perciò un particolare significato alcuni risultati di autori italiani (S. Ranzi e collaboratori 1945-46): l'azione di certe sostanze (solfocianati di Na) produce, negli anfibî, embrioni con corda e sistema nervoso ipersviluppati, e ciò è stato riferito ad un aumento del metabolismo glucidico con conseguente iperproduzione di sostanza induttrice.

Tutto ciò dimostra l'enorme importanza di tutto quel gruppo di ricerche eseguite con sensibilissimi micromanometri, microrespirometri e ultramicrorespirometri (J. Brachet, J. Needham e collab., K. Linderström Lang, P. E. Lindahl, A. Stefanelli) miranti al controllo delle attività metaboliche di quelle regioni ove, con particolare intensità, si manifestano le attività morfogenetiche, in primo luogo la regione dell'organizzatore.

In precedenza anzi, con altri esperimenti, si era anche cercato di influenzare il metabolismo dell'organizzatore, sottoponendo le uova a gradienti termici, raffreddando cioè o riscaldando una metà dell'uovo (stadio di gastrula) o sottoponendolo a deficienze localizzate di ossigeno. Si riusciva così a sdoppiare l'azione organizzatrice del cordo-mesoderma dimostrandone la bilateralità (W. Vogt 1927, F. G. Gilchrist 1928, J. Huxley, G. Castelnuovo).

Le ricerche sulla chimica degli organizzatori hanno dimostrato che svariate sostanze agenti forse direttamente, forse indirettamente liberando il principio induttore, forse producendo una citolisi, forse elevando il metabolismo di tessuti non induttori (blu di metilene, ad es.), possono produrre nell'ectoderma indifferente delle induzioni neurali, ma sia in questi casi come del resto in tutti gli altri di induzioni provocate da organizzatori "morti", da estratti embrionali, ecc., non si realizzano delle vere induzioni, come quelle provocate dal labbro blastoporale trapiantato, bensì soltanto, in grado più o meno accentuato, delle "evocazioni" nel tessuto reagente di strutture nervose non organizzate a costituire un nevrasse armonico e mai materiali mesodermici (corda, somiti). Manca in questi casi all'induzione ciò che C. H. Waddington ha chiamato l'"individuazione", cioè la qualifica regionale della struttura indotta.

Ecco perché nella chimica delle induzioni embrionali deve parlarsi di "evocatore" e non di "organizzatore", questo termine dovendo essere riservato a quello vivente del blastoporo.

Le concezioni correnti sulla chimica dell'evocatore sono le seguenti: quella della scuola tedesca (F. G. Fischer e collaboratori) dalla quale dapprincipio fu sostenuto che l'evocatore fosse il glicogeno; dopo, scartata questa ipotesi, lo stimolo induttore fu riferito ad una azione non specifica di un acido d'alto peso molecolare; l'altra della scuola inglese di Cambridge (J. Needham, C. H. Waddington ecc., 1934) che riferisce l'evocatore a una sostanza (solubile in etere ed in etere di petrolio) del gruppo degli steroli. Le preparazioni con differenti idrocarburi sintetici policiclici provocano infatti chiare induzioni. Interessante per le prospettive di indagine che ha fatto intravvedere, la parentela chimica, attraverso il gruppo del fenantrene, fra sostanze inducenti e sostanze cancerigene.

Ma tanto all'ipotesi degli acidi, quanto a quella degli steroli non si possono ricondurre le induzioni ottenute col blu di metilene e, tanto nell'un caso, che nell'altro rimane sempre a spiegare se si tratta di una azione inducente diretta o indiretta con la liberazione della sostanza attiva (sterolo o acido?) per citolisi o per rottura di un complesso inattivo (proteina, glicogeno, sterolo).

Più di recente, ricercando nella gastrula normale la localizzazione e distribuzione dei ribonucleoproteidi, è stata rilevata (J. Brachet) una diminuzione dell'acido ribonucleinico durante l'invaginazione del mesoderma, un accumulo di ribonucleoproteidi fra tetto archenterico e piastra midollare presuntiva e un contemporaneo arricchimento in acido ribonucleinico nel sistema nervoso secondo un gradiente. Questi fatti hanno suggerito al Brachet la tesi di una relazione diretta fra attività organizzatrici, induzione e sintesi dell'acido nucleinico, ipotesi veramente suggestiva oggi che da più parti viene prospettata la necessità di questi acidi per importanti sintesi biologiche.

Svariate considerazioni fanno dunque dedurre che l'evocatore è uno stimolo non specifico che eccita delle potenze latenti nell'ectoderma, senza però assicurare una regolare morfogenesi; fra le differenti sostanze chimiche (steroli, idrocarburi cancerigeni ed estrogeni, acidi grassi, nucleoproteidi, ecc.) alcuni sono attivi evocatori ed altri meno. Per spiegare invece l'induzione neurale nello sviluppo normale è necessario ammettere una certa specificità d'azione della sostanza stimolante emessa dal substrato mesodermico. Ben poco poi si sa ancora delle reazioni che debbono prodursi nell'ectoderma che soggiace allo stimolo evocatore.

Una nozione che è stata introdotta di recente (C. H. Waddington) nella analisi del funzionamento degli organizzatori dello sviluppo è quella di "competenza" del tessuto reagente. È una predisposizione di questo verso un differenziamento specifico, ciò che W. Vogt ha chiamato Bahnung (istradamento o preparazione alla determinazione). Questa capacità a reagire a una sostanza evocatrice, ad un organizzatore, che varia col procedere dello sviluppo, fa sì, ad es., che lievi variazioni del mezzo possano produrre in espianti di ectoderma il differenziamento di strutture nervose; ciò che significa che esiste veramente questa predisposizione dell'ectoderma a differenziarsi in questo senso e, in genere, a seconda dello stadio, soltanto in strutture che nello sviluppo normale traggono origine da questo foglietto.

Altre nozioni, infine, l'embriologia sperimentale ha introdotto: così quella dinamica di "campi embrionali" o n morfogenetici" che sono sistemi di attività specifiche che conducono alla formazione di determinati organi. In un certo senso corrispondono alle antiche localizzazioni, ma, a differenza di queste, i "campi" s'influenzano a vicenda e determinano regionalmente la qualità dell'induzione. Sulla natura chimica e fisica di questi "campi" ben poco ancora si sa. Ross G. Harrison ha emesso l'ipotesi che essi differiscano nell'ordinamento spaziale e nella configurazione delle molecole proteiche in dipendenza dei cambiamenti chimici che si verificano nello sviluppo. Da qui la necessità dello studio delle ultrastrutture del citoplasma durante il differenziamento embrionale, studio che per certi abbozzi polarizzati (arto, orecchio) è stato già iniziato con l'esame di detti abbozzi ai raggi X (R. G. Harrison, W. T. Astbury e K. Rudall, 1940).

Legata alla precedente, la nozione di "gradienti di metabolismo" di C. M. Child che è stata chiamata in causa per spiegare le complesse attività di sviluppo; ad essi si sono volute anche riferire (J. Huxley) le attività degli organizzatori, ma le ricerche fin'oggi compiute, di già menzionate, sono sfavorevoli a questa ipotesi, giacché il carattere dei gradienti di Child è nettamente "quantitativo", laddove nell'uovo si tratta essenzialmente di metabolismi "qualitativamente" differenti e piuttosto di gradienti di sostanze o meglio di attività definite.

Tra le grandi conquiste della scienza delle prime quattro decadi del nostro secolo, con i portati della fisica nucleare, della biochimica, della genetica, debbono figurare ben a ragione i risultati dell'embriologia sperimentale in questo suo nuovo orientamento chimico, che hanno condotto verso una nuova teoria dello sviluppo embrionale. L'induzione da organizzatori è il fatto capitale di questo profondo rinnovamento nello studio del problema dello sviluppo; ad Hans Spemann giustamente spetta, perciò, un posto preminente nella storia della biologia del nostro secolo.

Bibl.: J. Brachet, Embryologie chimique, Parigi 1945; C. M. Child, Patterns and problems of development, Chicago 1941; J. Needham, Biochemistry and morphogenesis, Cambridge 1942; P. Pasquini, Le forze creatrici dell'uovo, Pisa 1947; C. H. Waddington, Organisers and genes, Cambridge 1940.